食品微生物檢測中微生物菌落總數(shù)測定細(xì)則
發(fā)布時間：2019-11-08 瀏覽次數(shù)：1457
菌落總數(shù)主要是作為判定食品被細(xì)菌污染程度的標(biāo)記，也可以應(yīng)用這一方法觀察食一中細(xì)菌的性質(zhì)以及細(xì)菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供科學(xué)依據(jù)，因此微生物檢測中菌落總數(shù)測定尤為重要。
一、微生物檢測中菌落總數(shù)測定的幾項(xiàng)說明
1．菌落總數(shù)測定：
是以檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或者平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（根據(jù)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)要求選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基）混合后，每個細(xì)菌細(xì)胞都能形成一個可見的單獨(dú)菌落的假定為基礎(chǔ)的。由于檢驗(yàn)中采用37℃于有氧條件下培養(yǎng)(空氣中含氧約20％)，因而并不能測出每g或mL檢樣中實(shí)際的總活菌數(shù)，厭氧菌、微嗜氧菌和冷營菌在此條件下不生長，有特殊營養(yǎng)要求的一些細(xì)菌也受到了限制，因此所得結(jié)果，只包括一群能在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中發(fā)育、嗜中溫的、需氧和兼性厭氧的細(xì)菌菌落的總數(shù)。
2．鑒于檢樣中的細(xì)菌細(xì)胞是以單個，成雙、鏈狀、葡萄狀或成堆的形式存在，因而在菌落總數(shù)測定培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)的菌落可以來源于細(xì)胞塊，也可以來源于單個細(xì)胞，因此平板上所得需氧和兼性厭氧菌菌落的數(shù)字不應(yīng)報告活菌數(shù)，而應(yīng)以單位重量、容量或表面積內(nèi)的菌落數(shù)或菌落形成單位數(shù)(colony forming units，CFU)報告之。
3．每種細(xì)菌都有它一定的生理特性，培養(yǎng)時，應(yīng)用不同的營養(yǎng)條件及其他生理?xiàng)l件(如溫度、培養(yǎng)時間、pH、需氧性質(zhì)等)去滿足其要求，才能分別將各種細(xì)菌都培養(yǎng)出來。因此，要得到較全面的細(xì)菌菌落總數(shù)，應(yīng)將檢樣接種到幾種不同的非選擇性培養(yǎng)基上，并培養(yǎng)在不同條件下，如溫度，氧氣供應(yīng)等。
二、微生物檢測中菌落總數(shù)的測定
測定食品中菌落總數(shù)時，是將食品檢樣做成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從各個稀釋液中分別取出一定量在平皿內(nèi)與菌落總數(shù)測定培養(yǎng)基相混合，經(jīng)培養(yǎng)后，按一定要求計算出皿內(nèi)瓊脂平板培養(yǎng)基上所生成的細(xì)菌集落數(shù)，并再根據(jù)檢樣的稀釋倍數(shù)，計算出每g或mL樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。
三、微生物檢測中菌落總數(shù)測定中的一些要求和規(guī)定
為了正確地反映食品中各種需氧和兼性厭氧菌存在的情況，菌落總數(shù)測定時必須遵循以下一些要求和規(guī)定：
(一)所用器皿及稀釋液：
1. 檢驗(yàn)中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試管等必須是完全滅菌的，并在滅菌前徹底洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。
2. 用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對照。如果在瓊脂對照平板上出現(xiàn)幾個菌落時，要追加對照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。
3. 檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水，但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1％蛋白胨水為合適，因蛋白胨水對細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用，不會因?yàn)樵谙♂屵^程中而使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致死亡。如果對含鹽量較高的食品(如，醬品等)進(jìn)行稀釋，則宣采用蒸餾水。
(二)檢樣稀釋：
1. 檢樣稀釋時，應(yīng)以無菌手續(xù)稱取(或量取)有代表性的樣品25g(或mL)剪碎放于含有225ml滅菌稀釋液的玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖作成l：10的稀釋液。如系肉、魚等固體樣品，最好剪細(xì)于滅菌乳缽內(nèi)與稀釋液研勻，或與稀釋液同置于滅菌均質(zhì)器杯中（國產(chǎn)均質(zhì)器，目前以江蘇武進(jìn)鄭陸醫(yī)學(xué)儀器廠產(chǎn)品較簡便而實(shí)用），以8000～10000rpm速度攪拌1分鐘，使做成均勻的1：10稀釋液。
2. 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，將上述1:10的檢樣稀釋液再做成幾個適當(dāng)?shù)?0倍遞增稀釋液。即取1：10稀釋液1mL與9mL稀釋液混和做成l：100的稀釋液，然后依次遞增稀釋，做成1：1000、1：10000等稀釋液。注意每遞增稀釋一次，必須另換1支l mL滅菌吸管，這樣所得檢樣的稀釋倍數(shù)方為準(zhǔn)確。
3. 從吸管筒內(nèi)取出滅菌吸管時，不要將吸管尖端碰著其他仍留在容器內(nèi)的吸管的外露部分；而且吸管在進(jìn)出裝有稀釋液的玻璃瓶和試管時，也不要觸及瓶口及試管口的外側(cè)部分；因?yàn)檫@些部分都可能接觸過手或其他沾污物。
4. 在作10倍遞增稀釋中，吸管插入檢樣稀釋液內(nèi)不能低于液砸2.5cm；吸入液體時，應(yīng)先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端離開液面，將尖端貼于玻璃瓶或試管的內(nèi)壁使吸。管內(nèi)液體調(diào)至所要求的刻度，這樣取樣較準(zhǔn)確，而且在吸管從稀釋液內(nèi)取出時不會有多余的液體粘附于管外。
5. 當(dāng)用吸管將檢樣稀釋液加至另一裝有9mL空白稀釋液的試管內(nèi)時，應(yīng)小心沿管壁加入，不要觸及管內(nèi)稀釋液，以防吸管尖端外側(cè)部分粘附的檢液也混入其中。
(三)平板接種與培養(yǎng)：
1. 將稀釋液加至滅菌平皿內(nèi)時，應(yīng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)?biāo)本污染情況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移lmL稀釋液加入皿內(nèi)(從皿側(cè)加入，不要揭去皿蓋)，最后將吸管直立使液體流畢，并在皿底干燥處再擦一下吸管尖將余液排出，而不要吹出。每個稀釋度應(yīng)作2個平皿。
2. 用于傾注平皿的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)預(yù)先加熱使融化，并保溫于45±1℃恒溫水浴中待用。傾注平皿時，每皿內(nèi)傾入約15mL，最后將瓊脂底部帶有沉淀的部分棄去。
3. 為了防止細(xì)菌增殖及產(chǎn)生片狀菌落，在檢液加入平皿后，應(yīng)在20分鐘內(nèi)向皿內(nèi)傾入瓊脂，并立即使其與瓊脂混和均勻。
4. 檢樣與瓊脂混和時，可將皿底在平面上先向一個方向旋轉(zhuǎn)，然后再向相反的方向旋轉(zhuǎn)，以使充分混勻。旋轉(zhuǎn)中應(yīng)加小心，不要使混和物濺到皿邊的上方。為了保證混和均勻，而不濺及皿邊的上方，可使用江蘇省無錫縣衛(wèi)生防疫站童鶴泉設(shè)計制成的自動平皿旋轉(zhuǎn)儀，直接將加有檢樣的平皿放在旋轉(zhuǎn)儀上(可同時放4只平皿)，加入瓊脂后，開動電鈕，在數(shù)十秒鐘內(nèi)即可自動左右旋轉(zhuǎn)而使皿內(nèi)的檢樣與瓊脂混合均勻。
5. 皿內(nèi)瓊脂凝固后，不要長久放置，然后始翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)，而應(yīng)于瓊脂凝固后，在數(shù)分鐘內(nèi)即應(yīng)將平皿翻轉(zhuǎn)予以培養(yǎng)，這樣可避免菌落蔓延生長。必要時，可先將皿打開倒置(皿底向上)于溫箱內(nèi)經(jīng)15~60分鐘使瓊脂表面干燥后，再將皿底移至蓋內(nèi)倒置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)。這樣可以阻止運(yùn)動性強(qiáng)的變形桿菌屬、假單胞菌屬和芽胞桿菌屬中一些菌株在瓊脂表面擴(kuò)展生長。
6. 為了控制污染，在取樣進(jìn)行檢驗(yàn)的同時，于工作臺上打開一塊瓊脂平板培養(yǎng)基，其暴露的時間，應(yīng)與該檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長的時間相當(dāng)，然后與加有檢樣的平皿一并置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)，以了解檢樣在檢驗(yàn)操作過程中有無受到來自空氣的污染。
7. 培養(yǎng)溫度：
應(yīng)根據(jù)食品種類而定。肉、乳、蛋類食品用37℃培養(yǎng)，水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時間為48±2小時。其他食品，如，清涼飲料，調(diào)味品，糖果、糕點(diǎn)．果脯，酒類(主要為發(fā)酵酒)、豆制品和醬腌萊均系用37℃24±2小時培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度和時間之所以有這種不同的區(qū)分，乃是因?yàn)樵谥贫ㄟ@些食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于菌落總數(shù)的規(guī)定時，分別采用了不同的溫度和培養(yǎng)時間所取得的數(shù)據(jù)之故。水產(chǎn)品因來自淡水或海水，水底溫度較低，因而制定水產(chǎn)品細(xì)菌方面的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時，系用30℃作為培養(yǎng)的溫度。
(四)對照試驗(yàn)：
1. 加入平皿內(nèi)的檢樣稀釋液(特別是10：1的稀釋液)，有肘帶有食品顆粒，在這種情況下，為了避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一檢樣稀釋液與瓊脂混和的平皿，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境巾放置，以便在計數(shù)撿樣菌落時用作對照。
2. 為了防止檢樣中食品顆粒與菌落混淆，也可在已溶化而保溫于45℃水浴內(nèi)的瓊脂中，按每100ml加lmL，0.5％氯化三苯四氮唑(2，3，5triphenyltetrazolium chloride，TTC)水溶液之量加入適量的TTC。培養(yǎng)后，如是食品顆粒，不見變化，如為細(xì)菌，則生成紅色菌落，配好的TTC溶液，應(yīng)先用來與不加TTC的作對照，以觀察其對計數(shù)是否有不利的作用(TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用)。TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發(fā)生分解。無色的TTC是作為受氫體加入培養(yǎng)基中，如果有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后，在細(xì)菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲艏(formazan)，使菌落呈現(xiàn)紅色。
(五)菌落計數(shù)：
1. 從溫箱內(nèi)取出平皿進(jìn)行菌落計數(shù)時，應(yīng)先分別觀察同一稀釋度的兩個平皿和不同稀釋度的幾個平皿內(nèi)平板上菌落生長情況。平行試驗(yàn)的2個平板與菌落數(shù)應(yīng)該接近，不同稀釋度的幾個平板上菌落數(shù)則應(yīng)與檢樣稀釋倍數(shù)成反比，即檢樣稀釋倍數(shù)越大，菌落數(shù)越低，稀釋倍數(shù)越小，菌落數(shù)越高。
2. 計數(shù)菌落時，應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標(biāo)準(zhǔn)。1個稀釋度使用兩個平板，應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)；如其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。如在一個稀釋度的兩個平板中，一個平板的菌落數(shù)在30～300之間，另一個大于300或小于30時，則以菌落數(shù)在30～300間的平板作為計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。
3. 注意事項(xiàng)
(1)如果稀釋度大的平板上菌落數(shù)反比稀釋度小的平板上菌落數(shù)高，則系檢驗(yàn)工作中發(fā)生的差錯，屬實(shí)驗(yàn)室事故。此外，也可能因抑菌劑混入樣品中所致，均不可用作檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。
(2)如果平板上出現(xiàn)鏈狀菌落，菌落之間沒有明顯的界限，這是在瓊脂與檢樣混合時，一個細(xì)菌塊被分散所造成。一條鏈作為一個菌落計，如有來源不同的幾條鏈，每條鏈作為一個菌落計，不要把鏈上生長的各個菌落分開來數(shù)。此外，如皿內(nèi)瓊脂凝固后未及時進(jìn)行培養(yǎng)而遭受昆蟲侵入，在昆蟲爬過的地方也會出現(xiàn)鏈狀菌落，也不應(yīng)分開來數(shù)。
(3)如果所有平板上都有菌落密布，不要用多不可計作報告，而應(yīng)在稀釋度最大的平板上，任意數(shù)其中2cm2個，除2求出每cm2內(nèi)平均菌落數(shù)乘以皿底面積63.6cm2數(shù)，再乘其稀釋倍數(shù)作報告。例如10-1～10-3稀釋度的所有平板上均菌落密布，而在lO-3稀釋的平板上任數(shù)2個cm2。內(nèi)的菌落數(shù)是60個，皿底直徑為9cm，則該檢樣每g(或m1)中“估計”菌落數(shù)為：60／2×63．6×1000=1908000或1.9×106。
63.6cm2數(shù)系按皿底直徑為9cm時計算而得，即：(9／2)2×3．14=63．6；如所用平皿的皿底直徑不是9cm，則可按其直徑的實(shí)際cm數(shù)代人圓面積公式求出。
(4)菌落計數(shù)中，如能使用國產(chǎn)JLQ-S。型菌落計數(shù)器，則比較方便，燈光由側(cè)面射向平板，菌落易于觀察。由于儀器帶有電子音響訊號，用特制金屬探筆點(diǎn)數(shù)中，在發(fā)出音響之下始顯示數(shù)字增加，不會發(fā)生差錯。且燈光與平板之間夾有多用方格玻質(zhì)規(guī)板(方格面積為lcm2)，也有助于對菌落密布的平板進(jìn)行計數(shù)。
(5)檢樣如系微生物類制劑(如酸牛乳、酵母制酸性飲料)，則平板計數(shù)中應(yīng)相應(yīng)地將有關(guān)微生物(乳酸桿菌、酵母菌)排除，不可并入檢樣的菌落總數(shù)內(nèi)作報告。一般在校正檢樣的pH7．6后，再進(jìn)行稀釋和培養(yǎng)，此類嗜酸性微生物往往即不易生長。并可用革蘭氏法染色鑒別。染色鑒別時，要用不校正pH的檢樣做成相同稀釋度的稀釋液培養(yǎng)所生成的菌落涂片染色作對照，以資辨別。酵母菌卵圓形，遠(yuǎn)比細(xì)菌大，大小為2～5×5～30μm，革蘭氏陽性著色。乳酸桿菌在24小時內(nèi)，于普通營養(yǎng)瓊脂平板上在有氧條件下培養(yǎng)，通常是不生長的。
(六)報告方式
1. 菌落數(shù)小于100CFU 時,按“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報告。菌落數(shù)大于或等于100CFU 時,第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù),則報告菌落蔓延。若空白對照上有菌落生長,則此次檢測結(jié)果無效。
2. 檢樣為固體，用重量法取樣檢驗(yàn)時，以g為單位報告其菌落數(shù)；檢樣為液體，用容量法取樣檢驗(yàn)時，以mL為單位報告其菌落數(shù)；如檢樣為樣品表面的涂擦液，則應(yīng)以cm2為單位報告其菌落數(shù)。
3. 如檢樣為液體，在兩個平皿內(nèi)所加lmL未經(jīng)稀釋的檢樣(原液)培養(yǎng)中，均無細(xì)菌集落生成，則報告為lmL檢樣內(nèi)未有菌落生長，或1mL檢樣內(nèi)菌落數(shù)<1。
四、菌落總數(shù)測定的特殊方法
(一)平板表面涂布法
將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制成平板，經(jīng)50℃，l－2小時或35℃，18－20小時干燥后，于其上滴加檢樣稀釋液0.2mL，用L捧涂布于整個平板的表面，放置片刻(約10分鐘)，將平板翻轉(zhuǎn)，移至36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2小時(水產(chǎn)品用30℃培養(yǎng)48±2小時)，取出，按前述方式進(jìn)行菌落計數(shù)，然后乘以5(由0.2mL換算為1mL)，再乘以樣品稀釋的倍數(shù)，即得每g或mL檢樣所含菌落數(shù)。
此法較上述傾注法為優(yōu)，因菌落生長在表面，便于識別和檢查其形態(tài)，雖檢樣中帶有食品顆粒也不會發(fā)生混淆，同時還可使細(xì)菌不必遭受融化瓊脂的熱力，不致因此而使菌細(xì)胞受到損傷而不生長，從而可避免由于檢驗(yàn)操作中的不良因素而使檢樣中細(xì)菌菌落數(shù)降低。但是本法取樣量較傾注法為少(僅傾注法的五分之一)，代表性將受到一定的影響。
(二)平板表面點(diǎn)滴法
與涂布法相似，所不同者，只是用標(biāo)定好的微量吸管或注射器針頭按滴（使每滴相當(dāng)于0.025mi）將檢樣稀釋液滴加于瓊脂平板上固定的區(qū)域（預(yù)先在平板背面用標(biāo)記筆劃成四個區(qū)域），每個區(qū)域滴1滴，每個稀釋度滴兩個區(qū)域，作為平行試驗(yàn)。滴加后，將平板放平片刻（約5～10分鐘），然后翻轉(zhuǎn)平板，如前移入溫箱內(nèi)培養(yǎng)6～8小時后進(jìn)行計數(shù)，將所得菌落數(shù)乘以40（由0.025mL換算為1mL），再乘以樣品稀釋的倍數(shù)，即得每g或mL檢樣所含菌落數(shù)。
