中國工程院食品安全院士團(tuán)隊

科研成果轉(zhuǎn)化平臺

產(chǎn)品名稱：副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）
英文名稱：Rapid Detection Kit for Vibrio parahaemolyticus (Fluorescent Probe Assays)

產(chǎn)品編號與包裝規(guī)格：

產(chǎn)品簡介：本試劑盒僅適用于食品中副溶血性弧菌的定性檢測，其他試驗(yàn)需另按照國標(biāo)《GB4789.7-2013食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》開展。

檢測原理：基于Real Time PCR技術(shù)，利用針對于副溶血性弧菌特異性基因的引物、熒光探針以及其他反應(yīng)所需試劑，加入待檢樣品即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。在發(fā)生擴(kuò)增過程中，熒光探針與目的基因片段結(jié)合，可被Taq酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時熒光定量PCR儀可識別該熒光信號，同時根據(jù)其強(qiáng)弱變化繪制出相應(yīng)的實(shí)時擴(kuò)增曲線，進(jìn)而判定副溶血性弧菌是否檢出。

副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)產(chǎn)品組分：

儲存條件與保質(zhì)期：-20℃避光儲存，有效期為12個月，避免反復(fù)凍融。

靈敏度：最低檢驗(yàn)限達(dá)到100 CFU/Test

所需其他材料和適用儀器：熒光定量PCR儀（具有能夠檢測FAM標(biāo)記的熒光通道）、高速離心機(jī)、移液器、移液槍頭及離心管等。

副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)使用指南：

1，樣品前處理

   1) 樣品增菌液模板 DNA 的制備：
         a) 取25 g(mL)待檢樣品剪碎，置于225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水中，36 ℃±1 ℃前增菌8~18 h；
         b) 取以上增菌液1 mL到1.5 mL規(guī)格的無菌離心管中，6000 r/min離心5 min，完全去除上清；
         c) 加入30 μL裂解液充分懸浮管底沉淀，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱10 min；
         d) 12000 r/min離心15 min，上清即為待測樣品DNA，靜置冰上，長時間不用應(yīng)再次離心。

   2) 可疑菌落模板 DNA 的制備：挑取可疑菌落，充分懸浮于預(yù)先加有30 μL裂解液的無菌離心管中，后按照上述步驟c)、d)操作。

2, 加樣、反應(yīng)

   1) 按照需求取n個PCR反應(yīng)管（n=1管陰性對照+待檢測樣品數(shù)+1管陽性對照），從試劑盒中取出預(yù)混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入20 μL預(yù)混液，待用。
   2) 向上述n個反應(yīng)管中分別加入陰性對照、待測樣品DNA、陽性對照各5 μL，總反應(yīng)體積為25 μL。蓋緊管蓋，短暫離心，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
   3) PCR反應(yīng)體系為25 μL，取FAM檢測通道，在反應(yīng)階段2中60℃時收集熒光信號，具體程序如下：

3, 結(jié)果：一般情況下，可通過軟件自動設(shè)定的基線、閾值等直接讀取檢測結(jié)果。如需調(diào)整，可根據(jù)所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進(jìn)行調(diào)整。

   1) 質(zhì)量控制：陰性對照未出現(xiàn)明顯的S型擴(kuò)增曲線或Ct值＞35，陽性對照出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線且其Ct值＜30。若陰陽性對照不同時滿足上述條件，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。

   2) 結(jié)果判讀：（根據(jù)反應(yīng)所得Ct值判讀，具體見下表：）

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