糖尿病慢性傷口愈合：是全球糖尿病患者面臨的重要臨床挑戰(zhàn)，其病理特征包括炎癥失調、血管新生不足及角質形成細胞遷移受阻，導致高達34%的糖尿病患者出現(xiàn)難愈性潰瘍。皮膚傷口愈合的復雜過程：包括炎癥、增殖和重塑三個階段。糖尿病患者的傷口愈合過程常常受損，其特征是炎癥失調、血管生成減少和角質形成細胞遷移障礙。細胞外囊泡（EVs）的作用：其天然信號傳遞能力、低免疫原性和高生物相容性成為組織修復領域的研究熱點。EVs可通過遞送核酸、蛋白質等活性分子調控受體細胞的生物學功能，但其在蛋白質靶向遞送中的應用仍受限于載荷效率低、穩(wěn)定性差等問題。CDK1的關鍵作用：細胞周期依賴性激酶1（CDK1）是細胞周期進入的關鍵調控因子，驅動細胞分裂。在糖尿病傷口中，CDK1的表達下調，導致細胞增殖和遷移能力下降。CDK1的缺失會減少細胞增殖和脂質代謝，導致胰島素抵抗。
加州大學的Brian P. Eliceiri教授團隊于Molecular Therapy上發(fā)表了研究成果，構建了裝載CDK1的sEVs（CDK1-sEVs），并評估其在傷口微環(huán)境中介導細胞增殖、上皮再生及下游信號響應的能力。結果表明，sEV遞送CDK1能夠選擇性且短暫地刺激促進上皮再生的細胞類型增殖，并通過增強角質形成細胞增殖加速傷口愈合。
研究結果
1.CDK1-sEVs的構建與表征驗證
構建了一個含N端豆蔻?；蛄械腃DK1融合蛋白(myr-CDK1)，該蛋白可有效的裝載到sEVs中（圖1A）。
通過囊泡流式細胞術（vFC）測定了CDK1-sEVs和對照sEVs（Mock EVs）的濃度和大小分布，顯示兩者相似（圖1B-C） 。
vFC分析顯示CDK1-sEVs和Mock EVs表面表達的四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）相似（圖1D-G） 。
免疫印跡實驗顯示CDK1-sEVs中CDK1的表達增加，而Alix、CD63和CD81的水平相似，未檢測到內質網蛋白Calnexin （圖1E-F）。
免疫印跡實驗顯示CDK1的磷酸化狀態(tài)在CDK1-sEVs中未受影響（圖1G）。
圖1 CDK1-sEVs的表征
2. CDK1-sEVs對傷口愈合的促進作用
CDK1-sEVs處理的傷口閉合速度比Mock EVs處理的傷口更快，顯示出顯著的修復效果（圖2A） 。
H&E染色顯示CDK1-sEVs處理的傷口閉合速度比Mock EVs處理的傷口更快，顯示出顯著的修復效果（圖2B-C） 。
Ki67免疫組化染色顯示CDK1-sEVs處理的傷口中增殖細胞數量增加（圖2D-E） 。
CDK1-sEVs可在糖尿病傷口愈合早期階段顯著加速上皮再生與組織修復，且雙次給藥可進一步增強療效（圖2F-G） 。
圖2 測試CDK1-sEVs 在傷口愈合受損中的活性
3. CDK1-sEVs對人角質細胞的調節(jié)
免疫熒光染色顯示CDK1-sEVs處理的細胞中CDK1蛋白分布在細胞質中（圖3A）。
CDK1-sEVs處理細胞24小時后，HaCaT細胞數量較對照sEVs組增加25.6% （圖3B-C）。
在絲裂霉素C存在的條件下，CDK1-sEVs仍顯著加速劃痕閉合，無絲裂霉素C時，劃痕閉合速度更快，提示其直接促進細胞增殖及遷移的作用（圖3C-D）。
流式細胞術分析顯示CDK1-sEVs處理的細胞進入G2/M期的比例增加，表明其通過驅動細胞周期進程發(fā)揮功能（圖3E-F）。
圖3體外測試CDK1-sEVs對人角質形成細胞的活性
4. 外泌體CDK1在細胞質中的信號通路解析
與Mock-sEVs組相比，CDK1-sEVs處理后AKTSer473磷酸化水平升高約2倍（圖A-B），ERKThr202/Tyr204磷酸化水平升高約7.4倍（圖4C-D），而4E-BP1Thr37/46磷酸化水平升高約6倍（圖4E-F）。
免疫印跡實驗進一步驗證了AKT、ERK和4E-BP1的磷酸化水平增加（圖4G-I） 。
CDK1-sEVs對通路分子終點的磷酸化啟發(fā)作者考慮CDK1遞送對染色質結構的潛在影響。
圖4人角質形成細胞中CDK1-sEVs處理介導的下游信號轉導
5. CDK1-sEVs促進組蛋白磷酸化
CDK1-sEVs處理組的pHistone H3Ser10信號較對照sEVs組升高了2.8倍，表明CDK1通過ERK通路驅動染色質重塑（圖5A-B）。
免疫熒光染色顯示CDK1-sEVs處理的細胞中進入有絲分裂各階段的比例變化，特別是進入后期的細胞數量增加（圖5C-D）。
CDK1-sEVs能夠遞送具有生物化學活性的蛋白質有效載荷，這些有效載荷可加速傷口愈合，并促進細胞增殖、遷移以及細胞信號傳導。組蛋白 H3 磷酸化水平的升高突出顯示了這一點，而組蛋白 H3 的磷酸化促進了細胞進入分裂后期（圖6）。
圖5 CDK1-sEVs處理人角質形成細胞后組蛋白磷酸化分析
圖6 CDK1-sEVs作用于細胞的分子機制
創(chuàng)新點
1．CDK1-sEVs的開發(fā)：首次通過棕櫚酰化技術將CDK1裝載到sEVs中，為CDK1的穩(wěn)定遞送提供了一種新方法。
2．機制研究：揭示了CDK1-sEVs通過激活AKT/ERK信號通路和調控組蛋白H3磷酸化來促進細胞增殖和遷移的分子機制。
3．臨床應用潛力：CDK1-sEVs在糖尿病慢性傷口愈合中的顯著效果為開發(fā)新型治療策略提供了理論依據，特別是在慢性傷口愈合領域具有重要的臨床轉化潛力。
來源：微生物安全與健康網，作者~牛沁雅。
