研究背景
先進(jìn)治療藥物（ATMPs）是一類創(chuàng)新的治療方法，用于治療罕見、嚴(yán)重和慢性疾病，特別是在傳統(tǒng)療法效果不足的情況下。ATMPs主要包括基于體細(xì)胞、干細(xì)胞、基因和組織工程的療法，旨在修復(fù)受損細(xì)胞或組織并治療退行性疾病。然而，ATMPs的生產(chǎn)涉及體外細(xì)胞培養(yǎng)，容易受到微生物污染。由于目前的細(xì)胞治療產(chǎn)品（CTPs）生產(chǎn)工藝無法進(jìn)行終端滅菌，因此必須在輸注前進(jìn)行無菌檢測(cè)以確保安全性。目前，行業(yè)普遍采用的無菌檢測(cè)方法為USP<71>方法（美國(guó)藥典第71章記錄的無菌檢測(cè)法），但該方法最初針對(duì)大批量藥品設(shè)計(jì)，不完全適用于ATMPs。此外，該方法依賴14天的培養(yǎng)和肉眼觀察濁度來判斷污染，其CTPs本身的培養(yǎng)基成分可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，且操作繁瑣、易引入污染。
近日，新加坡-麻省理工學(xué)院研究聯(lián)盟、新加坡A*SRL實(shí)驗(yàn)室、新加坡國(guó)立大學(xué)、美國(guó)麻省理工學(xué)院的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)提出了一種基于機(jī)器學(xué)習(xí)輔助的紫外吸收光譜法，用于實(shí)時(shí)、無標(biāo)記、非侵入式的微生物污染檢測(cè)。該方法利用間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）培養(yǎng)物的光譜數(shù)據(jù)，訓(xùn)練單類支持向量機(jī)（SVM）模型，通過異常檢測(cè)識(shí)別污染。實(shí)驗(yàn)證明，該方法可在21小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到低至10 CFU的微生物污染，并在不同供體MSC中驗(yàn)證了其穩(wěn)健性。這一技術(shù)有望整合到CTP生產(chǎn)過程中，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)、低成本的無菌監(jiān)測(cè)。
研究主要內(nèi)容及結(jié)果
（1）使用機(jī)器學(xué)習(xí)輔助紫外吸收光譜檢測(cè)大腸桿菌的時(shí)間探究（圖1）：為驗(yàn)證所提出方法的靈敏度，本研究考察了污染物檢測(cè)所需時(shí)間。初步實(shí)驗(yàn)選用在富含營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基（如DMEM培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)迅速的大腸桿菌K-12（ATCC 25404）。需注意的是，臍帶血來源的細(xì)胞治療產(chǎn)品中偶見大腸桿菌污染，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將擴(kuò)展至更多微生物。研究將10 CFU的大腸桿菌接種至單一供體（供體A）的MSC培養(yǎng)物中，并在9至24小時(shí)間隔3小時(shí)采集三次上清液樣本。所有樣本（含陰陽性對(duì)照）均通過光譜儀三重測(cè)量，并利用基于供體A無菌PBS樣本訓(xùn)練的單類SVM模型評(píng)估吸光度數(shù)據(jù)。模型在約21小時(shí)后成功檢測(cè)到10 CFU大腸桿菌污染，此時(shí)所有陰性對(duì)照被判定為無菌，陽性對(duì)照均為污染（100%真陽性和真陰性）。總檢測(cè)時(shí)間（含樣本提取、光譜測(cè)量和SVM分析）約為21.5小時(shí)，證實(shí)該方法可檢測(cè)低菌量（10 CFU）污染。通過扣除陰性對(duì)照（PBS處理的供體AMSC上清）吸光度均值，對(duì)比陽性對(duì)照（含1000 CFU大腸桿菌的DMEM）和測(cè)試樣本（10 CFU大腸桿菌）的吸光度變化。結(jié)果表明高菌量陽性對(duì)照的吸光度增長(zhǎng)更顯著，而10 CFU樣本的變化在18小時(shí)后明顯，導(dǎo)致21小時(shí)被判定為污染。
圖1 大腸桿菌加標(biāo)樣本在9小時(shí)至24小時(shí)時(shí)間區(qū)間內(nèi)每隔3小時(shí)測(cè)得的平均吸光度光譜結(jié)果圖。a.陽性對(duì)照（1000 CFU大腸桿菌加標(biāo)樣本，橙色曲線）扣除同時(shí)間點(diǎn)陰性對(duì)照樣本平均吸光度后的光譜變化。可觀察到9小時(shí)至18小時(shí)期間吸光度快速上升，之后增幅趨于平緩。b.低菌量組（10 CFU大腸桿菌加標(biāo)樣本，深藍(lán)色曲線）扣除同時(shí)間點(diǎn)陰性對(duì)照后的光譜變化。21小時(shí)和24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的吸光度上升尤為顯著。
（2）檢測(cè)其他微生物污染物：為驗(yàn)證該方法的適用性，研究對(duì)USP<71>標(biāo)準(zhǔn)菌株（如金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌等）及緩慢生長(zhǎng)的微生物（如痤瘡丙酸桿菌）進(jìn)行了盲法測(cè)試。結(jié)果表明該機(jī)器學(xué)習(xí)輔助紫外光譜法可廣譜檢測(cè)多種微生物污染（包括快/慢生長(zhǎng)菌），靈敏度達(dá)10 CFU，且不受培養(yǎng)代次干擾。結(jié)合LC-MS揭示的煙酸代謝差異，證實(shí)其通過光譜特征識(shí)別污染的可行性，為細(xì)胞治療產(chǎn)品的無菌監(jiān)測(cè)提供了高效、通用的解決方案。
（3）機(jī)器學(xué)習(xí)輔助紫外吸收光譜法的穩(wěn)定性研究（圖2和圖3）。供體間差異（如組織來源、年齡、性別和生理狀態(tài)）是影響MSC療效的關(guān)鍵因素。為驗(yàn)證所開發(fā)模型的普適性，研究測(cè)試了6種商業(yè)供體（B-G）的樣本。通過紫外光譜分析發(fā)現(xiàn)，供體A和B的無菌樣本預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率最高（分別為81.2%和65.6%），因此選擇它們訓(xùn)練SVM模型。方法對(duì)7種微生物的污染檢測(cè)限仍為10 CFU，真陽性率達(dá)92.7%（最低準(zhǔn)確率為枯草芽孢桿菌樣本）。真陰性率為77.7%，其中14個(gè)假陽性樣本中10例來自供體F。LC-MS分析表明，供體F無菌樣本的煙酸（NA）基線濃度（>2×10? counts）顯著高于訓(xùn)練集供體A/B（1.6×10? counts），導(dǎo)致模型誤判?？偟膩碚f，該方法對(duì)多數(shù)供體具有良好適用性，但需優(yōu)化以降低供體間代謝差異（如NA濃度）的干擾，進(jìn)一步提升特異性。
圖2 混淆矩陣與分類報(bào)告顯示：基于供體A和B的PBS加標(biāo)樣本訓(xùn)練的SVM模型，在評(píng)估6個(gè)商業(yè)MSC供體（B-G）418份測(cè)試樣本無菌狀態(tài)時(shí)，取得92.7%的真陽性準(zhǔn)確率與77.7%的真陰性準(zhǔn)確率。
圖3 基于供體A和B樣本訓(xùn)練的SVM模型對(duì)不同微生物在10 CFU濃度下的檢測(cè)限與準(zhǔn)確率
研究結(jié)論
本研究開發(fā)了一種基于紫外吸收光譜和機(jī)器學(xué)習(xí)的新型快速無菌檢測(cè)技術(shù)，能夠以簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)和非侵入的方式在21小時(shí)內(nèi)檢測(cè)低至10 CFU的多種微生物污染（平均真陽性率92%）。該方法通過煙酸/煙酰胺代謝物的光譜差異識(shí)別污染，無需復(fù)雜培養(yǎng)步驟，且已驗(yàn)證其在跨供體MSCs中的適用性。盡管存在需擴(kuò)展微生物檢測(cè)范圍、優(yōu)化供體普適性等局限性，但其快速（<30分鐘）、低樣本需求（<1 mL）和自動(dòng)化兼容性優(yōu)勢(shì)，使其有望整合到細(xì)胞治療產(chǎn)品（CTP）生產(chǎn)流程中，作為實(shí)時(shí)污染監(jiān)測(cè)的初步篩查工具。未來通過對(duì)接自動(dòng)化采樣系統(tǒng)，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測(cè)，提升CTP生產(chǎn)的安全性控制效率。
論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41598-024-83114-y
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~馮燕梅。
