在食品安全領(lǐng)域,致病菌的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)一直是研究的重點(diǎn)。近期,《Food Chemistry》雜志上發(fā)表的一篇研究論文介紹了一種新型的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR-高分辨率熔解分析(duplex qPCR-HRMA)技術(shù),為檢測(cè)肉類(lèi)中的單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)和鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium)提供了新的解決方案。
致病菌檢測(cè)的重要性
單核細(xì)胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌是兩種常見(jiàn)的食源性致病菌,它們?cè)谌蚍秶鷥?nèi)對(duì)食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。單核細(xì)胞增生李斯特菌主要通過(guò)污染的肉類(lèi)、乳制品等傳播,可導(dǎo)致嚴(yán)重的李斯特菌病,尤其對(duì)孕婦、兒童、老年人和免疫力低下者危害極大。鼠傷寒沙門(mén)氏菌則廣泛存在于動(dòng)物源性食品中,每年導(dǎo)致約1.5億人患病,平均6萬(wàn)人死亡。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如培養(yǎng)法雖然準(zhǔn)確,但耗時(shí)長(zhǎng),無(wú)法滿足現(xiàn)代食品行業(yè)快速檢測(cè)的需求。因此,開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏且準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)顯得尤為重要。
雙重qPCR-HRMA技術(shù)原理
qPCR是一種基于熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)目標(biāo)DNA序列。HRMA則是一種基于PCR產(chǎn)物熔解曲線差異的分析技術(shù),可以在不使用額外探針的情況下區(qū)分不同的DNA序列。雙重qPCR-HRMA技術(shù)將兩者結(jié)合,通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的特異性引物,分別擴(kuò)增兩種致病菌的特定基因片段,然后通過(guò)HRMA分析其熔解曲線的差異,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種致病菌的同時(shí)檢測(cè)。
靈敏度與準(zhǔn)確性
研究中,雙重qPCR-HRMA技術(shù)表現(xiàn)出極高的靈敏度和準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該技術(shù)的反應(yīng)靈敏度可達(dá)2皮克(pg)DNA,相當(dāng)于單核細(xì)胞增生李斯特菌124個(gè)拷貝和鼠傷寒沙門(mén)氏菌100個(gè)拷貝。
表1 雙重qPCR-HRM檢測(cè)方法的反應(yīng)靈敏度。靈敏度評(píng)估采用單核細(xì)胞增生李斯特菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的DNA十倍梯度稀釋系列,起始濃度為20 ng。測(cè)試了每個(gè)稀釋系列中兩種菌的雙重檢測(cè)情況,并記錄熔解值。
圖1 用于確定反應(yīng)靈敏度的高分辨率熔解分析。(A) 標(biāo)準(zhǔn)化溫度曲線圖表顯示紅色簇中雙重檢測(cè)的雙拐點(diǎn),(B) 溫度偏移差異曲線圖表顯示熔解曲線形狀和顏色的差異(紅色簇——在五個(gè)稀釋系列內(nèi)檢測(cè)到單核細(xì)胞增生李斯特菌在76℃和鼠傷寒沙門(mén)氏菌在80℃的雙拐點(diǎn)反應(yīng))。在第六個(gè)稀釋系列中僅檢測(cè)到(藍(lán)色簇),表明該反應(yīng)足夠靈敏,可檢測(cè)到直至第五個(gè)稀釋系列的兩種病原體。
在模擬污染的肉類(lèi)樣本中,該技術(shù)的檢測(cè)限為每毫升150個(gè)菌落形成單位(CFU),這一檢測(cè)限遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)培養(yǎng)法和其他一些分子生物學(xué)方法。此外,該技術(shù)還通過(guò)了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 22118:2011的標(biāo)準(zhǔn)化和驗(yàn)證,確保了其在實(shí)際應(yīng)用中的可靠性和準(zhǔn)確性。
實(shí)際應(yīng)用
為了驗(yàn)證該技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,研究人員進(jìn)行了多方面的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。首先,通過(guò)比對(duì)不同致病菌的熔解曲線,驗(yàn)證了引物的特異性。接著,通過(guò)稀釋系列實(shí)驗(yàn)確定了反應(yīng)靈敏度,并在模擬污染的肉類(lèi)樣本中測(cè)試了方法靈敏度。此外,還通過(guò)改變反應(yīng)體系和設(shè)備等條件,評(píng)估了該技術(shù)的穩(wěn)健性。最終,通過(guò)盲測(cè)驗(yàn)證和實(shí)際樣本檢測(cè),進(jìn)一步證明了該技術(shù)在檢測(cè)真實(shí)世界樣本中的有效性和可靠性。
表2 對(duì)25份商業(yè)樣品(C-1至C-30)和4份監(jiān)管樣品(R-1至R-4)的實(shí)際樣品評(píng)估。所開(kāi)發(fā)的qPCR-HRM檢測(cè)結(jié)果經(jīng)VITEK 2細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(美國(guó)生物梅里埃公司)驗(yàn)證。
未來(lái)展望:食品安全檢測(cè)的新方向
雙重qPCR-HRMA技術(shù)的誕生,標(biāo)志著食源性致病菌檢測(cè)從“單一、滯后”向“多重、即時(shí)”時(shí)代的跨越。隨著全球食品安全標(biāo)準(zhǔn)的日益嚴(yán)格,這類(lèi)兼具高效性與經(jīng)濟(jì)性的分子檢測(cè)技術(shù),將成為食品生產(chǎn)、加工、監(jiān)管各環(huán)節(jié)的“標(biāo)配”工具,為消費(fèi)者餐桌筑起更堅(jiān)實(shí)的安全防線。正如研究團(tuán)隊(duì)所言,該技術(shù)不僅是實(shí)驗(yàn)室的創(chuàng)新成果,更是“推動(dòng)全球食品供應(yīng)鏈微生物風(fēng)險(xiǎn)管理的重要一步”。
參考文獻(xiàn):Ajay G, Vishnuraj M R, Kumar N A, et al. A novel duplex qPCR-HRMA technique for simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Salmonella typhimurium in meat products[J]. Food Chemistry, 2025, 474: 143245.
來(lái)源:微生物安全與健康網(wǎng),作者~蔡偉程。