研究背景
在當(dāng)今社會，城市污水、水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水和醫(yī)療廢水已成為沙門氏菌的重要儲存庫和傳播源。沙門氏菌是一種常見的人類食源性病原體，廣泛存在于人和動物體內(nèi)，并通過糞便排泄到環(huán)境中。它能在未經(jīng)處理的糞便和廢水中存活五個月至兩年之久，感染后可引發(fā)多種疾病，如菌血癥、胃腸炎、食物中毒等。因此，快速檢測廢水中的沙門氏菌對于有效降低疾病傳播風(fēng)險、保障公共衛(wèi)生安全至關(guān)重要。
然而，目前的沙門氏菌檢測方法存在諸多局限性。傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)雖被視為檢測“金標(biāo)準(zhǔn)”，但檢測周期長達(dá)4至7天，難以及時發(fā)現(xiàn)沙門氏菌污染；免疫學(xué)方法因缺乏特異性靶向抗體、存在交叉反應(yīng)等問題而應(yīng)用受限；分子生物學(xué)技術(shù)如多位點序列分型（MLST）和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等需要昂貴設(shè)備和專業(yè)人員操作；生物傳感器方法也因成本高昂難以廣泛推廣。此外，以往的DNA分子檢測方法無法區(qū)分活菌和滅活菌的DNA，可能導(dǎo)致對沙門氏菌風(fēng)險的高估，而RNA檢測方法又存在提取復(fù)雜、成本高等問題。
創(chuàng)新檢測平臺的誕生
在這樣的背景下，一項創(chuàng)新的研究成果應(yīng)運而生。2025年5月21日，《Microorganisms》雜志發(fā)表了一篇題為《Establishment of a Sensitive and Visual Detection Platform for Viable Salmonella in Wastewater That Combines Propidium Monoazide with Recombinase Polymerase Amplification—CRISPR/Cas12a System》的文章，介紹了一種新型的檢測平臺，該平臺結(jié)合了碘化丙啶單氮雜卓（PMA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，專門針對廢水中的活菌沙門氏菌進(jìn)行快速、靈敏且可視化的檢測。
創(chuàng)新點及優(yōu)勢
這項研究的創(chuàng)新之處在于巧妙地整合了多種先進(jìn)技術(shù)。PMA能夠選擇性地與死細(xì)胞的DNA結(jié)合，阻止其在后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)中被檢測到，從而有效區(qū)分活菌和死菌；RPA則是一種等溫擴(kuò)增技術(shù)，具有快速、操作簡便、成本低等優(yōu)點，相比傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，它不需要復(fù)雜的熱循環(huán)設(shè)備，且能在較短時間內(nèi)完成DNA的擴(kuò)增；CRISPR/Cas12a系統(tǒng)則以其高特異性和靈敏度著稱，能夠精準(zhǔn)識別目標(biāo)DNA序列，并通過其獨特的側(cè)切活性激活熒光信號，實現(xiàn)可視化檢測。三者的結(jié)合，不僅彌補了各自單獨使用時的不足，還充分發(fā)揮了各自的優(yōu)勢，為沙門氏菌的檢測提供了一種全新的解決方案。
研究結(jié)果
高特異性和靈敏度
特異性：對15種常見病原體進(jìn)行檢測，僅沙門氏菌屬（鼠傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌B型、腸炎沙門氏菌）顯示熒光信號，其他菌株均無反應(yīng)，表明該系統(tǒng)具有高度特異性。
圖1 15種常見病原體的可視化檢測結(jié)果（a）、熒光值和Ct值（b）。（泳道1至15分別對應(yīng)鼠傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌B型、腸炎沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、蠟樣芽孢桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸桿菌和枯草芽孢桿菌，C表示陰性對照。）注：不同大寫字母表示熒光值之間存在顯著差異（方差分析，P<0.05），不同小寫字母表示Ct值之間存在顯著差異（方差分析，P <0.05）。
靈敏度：在污水中，該系統(tǒng)對活沙門氏菌的最低檢測限為101 CFU/mL，且在101至10? CFU/mL濃度范圍內(nèi)均能產(chǎn)生明顯的熒光信號。
圖2 濃度范圍為100至108 CFU/mL的沙門氏菌的可視化檢測結(jié)果（a）、熒光值和Ct值（b）。圖表中，條形圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。
實際應(yīng)用
污水中活沙門氏菌的檢測應(yīng)用
人工接種廢水檢測：在人工接種不同濃度活沙門氏菌的廢水中，該系統(tǒng)能準(zhǔn)確檢測到101至10? CFU/mL的活沙門氏菌，而滅活沙門氏菌無信號。PCR和凝膠電泳結(jié)果進(jìn)一步驗證了該系統(tǒng)的有效性。
圖3 濃度范圍為101至108 CFU/mL的廢水中滅活及活沙門氏菌的可視化檢測結(jié)果（a）、凝膠電泳結(jié)果（b）、熒光值和Ct值（c,d）。圖表中，條形圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。
實際廢水樣本檢測：對24份實際廢水樣本進(jìn)行檢測，其中8份樣本（#2、6、10、12、13、16、20、24）顯示明顯的熒光信號，熒光強(qiáng)度和qPCR值一致，表明該系統(tǒng)在實際環(huán)境中具有良好的適用性。
圖4 24份實際廢水樣本檢測結(jié)果的可視化檢測（a）以及熒光值和Ct值（b）。圖表中，條形圖表示平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差。
討論與挑戰(zhàn)
盡管PMA處理能夠有效區(qū)分活菌和死菌，但在實際應(yīng)用中，仍需進(jìn)一步研究如何優(yōu)化PMA的處理條件，以確保其在不同類型的廢水樣本中都能發(fā)揮最佳效果。此外，對于現(xiàn)場應(yīng)用而言，還需要開發(fā)便攜式的熒光檢測設(shè)備，以便于在沒有專業(yè)實驗室設(shè)備的情況下進(jìn)行快速檢測。同時，實際廢水樣本中復(fù)雜的污染物成分可能會對DNA提取和擴(kuò)增過程產(chǎn)生干擾，如何快速、高效地從環(huán)境樣本中提取純凈的DNA，減少抑制物的影響，也是未來需要解決的問題。而且，一些廢水樣本的高濁度和顏色可能會阻礙藍(lán)光的有效照射，進(jìn)而影響PMA與DNA的結(jié)合效果和檢測靈敏度，這也是未來研究需要重點關(guān)注的方向。
總結(jié)與展望
這項研究成功建立了一種快速、靈敏且可視化的檢測平臺，能夠有效檢測廢水中的活菌沙門氏菌，為廢水處理廠和農(nóng)村污水處理設(shè)施中的病原體監(jiān)測和早期預(yù)警提供了有力的技術(shù)支持。通過優(yōu)化PMA處理條件和整合RPA與CRISPR/Cas12a技術(shù)，該系統(tǒng)不僅提高了檢測效率，還降低了檢測成本，有望在實際的廢水監(jiān)測工作中得到廣泛應(yīng)用。
隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和相關(guān)研究的深入，相信該檢測平臺將不斷完善。研究人員可能會進(jìn)一步探索PMA與其他檢測技術(shù)的結(jié)合，拓展其應(yīng)用范圍；同時，開發(fā)更加便攜、快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)場檢測設(shè)備，使其能夠更好地適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境條件，為保障公共衛(wèi)生安全和環(huán)境保護(hù)做出更大的貢獻(xiàn)。此外，對于其他類似的病原體檢測，該研究也提供了一種可借鑒的思路和方法，有望推動整個微生物檢測領(lǐng)域的發(fā)展。
參考文獻(xiàn)：Liang J, Sui X, Xu Y, et al. Establishment of a Sensitive and Visual Detection Platform for Viable Salmonella in Wastewater That Combines Propidium Monoazide with Recombinase Polymerase Amplification—CRISPR/Cas12a System[J]. Microorganisms, 2025, 13(5): 1166.
來源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~蔡偉程。
