細(xì)胞培養(yǎng)又失敗了？保姆級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)的詳細(xì)操作步驟來了！
發(fā)布時(shí)間：2023-03-21 瀏覽次數(shù)：541
細(xì)胞寶寶很嬌貴，無菌操作最重要。那么我們?nèi)绾螠?zhǔn)備無菌環(huán)境呢？
01. 操作器械滅菌>>
移液管吸頭高壓滅菌（或購買事先經(jīng)過滅菌的移液管吸頭）。
70% 酒精對(duì)物品表面消毒。
02. 超凈工作臺(tái)或生物安全柜>>
將超凈工作臺(tái)窗扇關(guān)閉到合適位置，以保證空氣層流。
凈化工作區(qū)禁止堆放雜物，干擾潔凈氣流流動(dòng)。
工作前消毒工作臺(tái)面，打開紫外燈消毒。工作結(jié)束后清理消毒臺(tái)面，并進(jìn)行紫外消毒。
具有潛在感染性的材料需在生物安全柜中處理，禁止使用超凈工作臺(tái)。
03. 試劑無菌>>
所有培養(yǎng)基、添加劑和試劑必須無菌，防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中微生物生長。如果某些試劑和添加劑未以無菌形式提供，則需要對(duì)其進(jìn)行過濾除菌或高壓滅菌。此外，試劑需在無菌條件下配置和使用，以確保它們始終處于無菌狀態(tài)。
請(qǐng)記??！無菌操作貫穿細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)始終！
接下來，我們要為細(xì)胞寶寶準(zhǔn)備合適的食物。
細(xì)胞培養(yǎng)前，需要先查詢細(xì)胞系相關(guān)信息，以確定適合的培養(yǎng)基類型以及添加劑等。大多數(shù)細(xì)胞系可以使用MEM、 DMEM 培養(yǎng)基或RPMI等基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并要添加一定比例的胎牛血清（FBS）。
細(xì)胞寶寶還需要合適的環(huán)境，才能健康長大。
細(xì)胞培養(yǎng)需要控制細(xì)胞所處的溫度、pH、滲透壓、O2和CO2。
pH：大部分細(xì)胞在pH 7.4左右生長良好。
CO2：一般需要在專用的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置為5% CO2。
溫度：大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溫度為37°C。禽類細(xì)胞在38.5°C生長最佳。昆蟲細(xì)胞最佳生長溫度是27°C。冷血?jiǎng)游锛?xì)胞系可在15-26°C范圍內(nèi)培養(yǎng)。
細(xì)胞培養(yǎng)容器：大多數(shù)細(xì)胞系在專用的細(xì)胞培養(yǎng)瓶上生長，不需要特殊的基質(zhì)等。但一些細(xì)胞，特別是原代細(xì)胞，需要在特殊的基質(zhì)（如膠原蛋白）上生長，以促進(jìn)細(xì)胞貼壁、分化或生長。建議查閱相關(guān)文獻(xiàn)，詳細(xì)了解您正在培養(yǎng)的細(xì)胞。
細(xì)胞寶寶很孤獨(dú)，我們需要每天去呵護(hù)哦。
每天用顯微鏡觀察細(xì)胞，以監(jiān)測(cè)其健康狀況、生長速度和融合度（單層細(xì)胞覆蓋的表面積百分比）。貼壁細(xì)胞應(yīng)主要附著在培養(yǎng)瓶底部，呈貼壁形態(tài)（取決于不同細(xì)胞系）。懸浮細(xì)胞應(yīng)呈圓形形態(tài)。一般可以把細(xì)胞形態(tài)分為三種基本形態(tài)：
含酚紅的培養(yǎng)基為粉紅色/橙色（培養(yǎng)基顏色會(huì)隨 CO 2 濃度發(fā)生變化）。含酚紅培養(yǎng)基呈淡黃色表示其pH 值降低呈酸性，通常與污染或細(xì)胞不健康有關(guān)。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)建議使用不含酚紅的培養(yǎng)基，避免干擾圖像采集。如果出現(xiàn)以下情況，請(qǐng)丟棄細(xì)胞：
細(xì)胞大量脫落（貼壁細(xì)胞系）和/或看起來干癟并呈顆粒狀/深色。
細(xì)胞處于停止生長狀態(tài)。
細(xì)胞寶寶需要一定的生活空間，太擁擠就需要搬家啦。
一般細(xì)胞融合度達(dá)到約 80%（即80% 的培養(yǎng)瓶表面被單層細(xì)胞覆蓋）時(shí)，即需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。不建議細(xì)胞過度融合（達(dá)到100%）時(shí)傳代，因?yàn)檫@可能會(huì)影響細(xì)胞活性。
細(xì)胞傳代需要注意分板比/接種密度。不同的細(xì)胞系通常需要滿足特定的分板比/接種密度，務(wù)必查看所用細(xì)胞系的培養(yǎng)指南。生長較快的細(xì)胞可能需要高分板比（低接種密度），而生長緩慢的細(xì)胞可能需要低分板比（較高接種密度）。
如果細(xì)胞長時(shí)間無人看管（例如公共假日或周末），建議使用低于正常水平的分板比/接種密度。但是一些細(xì)胞，特別是原代細(xì)胞生長具有密度依賴性，過低的接種密度可能導(dǎo)致無法生長。
細(xì)胞分板比/接種密度需要通過對(duì)樣品中的細(xì)胞計(jì)數(shù)確定。細(xì)胞計(jì)數(shù)一般可使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。
下面我再詳細(xì)說說細(xì)胞傳代的方法：
01. 貼壁細(xì)胞系>>
貼壁細(xì)胞一般需要使用胰蛋白酶等消化液，但其可能會(huì)損傷細(xì)胞，還可能會(huì)誘使某些膜蛋白暫時(shí)內(nèi)化，因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮到這一點(diǎn)。這時(shí)，可使用其他溫和消化試劑替代。以下是貼壁細(xì)胞傳代的一般步驟：
請(qǐng)注意：
PBS洗滌是為完全除去殘留的胎牛血清（FBS）、鈣和鎂等。必要時(shí)可多次洗滌（某些細(xì)胞系貼壁牢固，需多次沖洗才能徹底去除殘留 FBS），促進(jìn)胰蛋白酶消化。
胰蛋白酶用量以覆蓋培養(yǎng)瓶底部為宜，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，確保消化液與所有細(xì)胞接觸。
將培養(yǎng)瓶放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱中，更適合消化酶的消化。不同細(xì)胞消化時(shí)間不同，為避免因過度消化而嚴(yán)重破壞細(xì)胞，必須每隔幾分鐘進(jìn)行一次檢查。
02. 半貼壁細(xì)胞系>>
一些細(xì)胞系介于懸浮和貼壁細(xì)胞之間，針對(duì)松散貼壁細(xì)胞，可不使用消化液，而使用移液管溫柔吹打，使細(xì)胞分散。以下是半貼壁細(xì)胞傳代的一般步驟：
03. 懸浮細(xì)胞系>>
懸浮細(xì)胞傳代難度略低于貼壁細(xì)胞，無需經(jīng)消化處理。以下是懸浮細(xì)胞傳代的一般步驟：
請(qǐng)注意：
一些懸浮細(xì)胞生長過程中可能結(jié)團(tuán)，可添加 Pluronic PF68 等解離試劑使團(tuán)塊分散。
懸浮細(xì)胞多次傳代后，細(xì)胞碎片和代謝廢物會(huì)不斷積累，可將細(xì)胞懸液以 100 × g離心 5 - 10 分鐘，棄去上清液，將細(xì)胞沉淀重懸在新鮮培養(yǎng)基中。
小貼士
細(xì)胞傳代需要注意細(xì)胞的傳代次數(shù)（細(xì)胞經(jīng)歷的傳代培養(yǎng)次數(shù)）。培養(yǎng)中應(yīng)記錄傳代次數(shù)，細(xì)胞代次過高，可能會(huì)發(fā)生遺傳漂變或其它變異，影響您的實(shí)驗(yàn)。
低代次細(xì)胞，以及一些自己建立的特殊細(xì)胞系需要盡量多凍存幾管，以防細(xì)胞污染等情況造成您實(shí)驗(yàn)中斷。
培養(yǎng)細(xì)胞是個(gè)精細(xì)活，要考慮到實(shí)驗(yàn)的方方面面，才能得到理想狀態(tài)的細(xì)胞。最后一起看看細(xì)胞凍存、復(fù)蘇和細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活測(cè)試!
01. 細(xì)胞凍存>>
目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由冰晶形成的細(xì)胞損傷。
10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細(xì)胞凍存。
取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長的細(xì)胞消化下來，懸浮生長的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中。
離心1000 rpm,5 min.
去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5x10^6/ml~1x10^7/ml.
在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者。
凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)到-25℃以下時(shí)，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。
02. 細(xì)胞復(fù)蘇>>
從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。
從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。
離心，1000 rpm，5 min。
棄去上層清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
03. 細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活測(cè)試>>
原理：
(1) 計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。
(2) 血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。
(3) 存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長，部分活細(xì)胞也開始攝取染料;因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。
材料：0.4%w/v trypan blue;Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計(jì)數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計(jì)數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細(xì)胞稀釋液(4%乙酸溶液)。
步驟：
(1)取50μl細(xì)胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
(2)取少許混合液(約15μl)自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-Erythrosin bluish)。
(3)計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。
注：4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4=細(xì)胞數(shù)/ml;每一大格的體積=2.5px×2.5px×0.25px=10-4ml
計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，最適濃度為5～10×105細(xì)胞/ml，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。
小貼士
冷凍越慢越好，復(fù)蘇越快越好
操作人員在接觸液氮罐時(shí)應(yīng)戴防護(hù)面罩、防護(hù)手套，穿防護(hù)衣，防止凍存管或氣體爆裂對(duì)人體造成傷害。在存放液氮罐的房間中也應(yīng)裝有檢測(cè)氣體濃度的報(bào)警裝置，防止人員暈厥的現(xiàn)象發(fā)生。大家在做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候一定要小心操作、注意安全。
凍存細(xì)胞數(shù)量要足夠，一般最低要達(dá)到5x10^6/ml。濃度視情況而定。
做好標(biāo)記：培養(yǎng)瓶上應(yīng)該用馬克筆做好標(biāo)記，寫上細(xì)胞名稱、代數(shù)和凍存時(shí)間。
對(duì)剛復(fù)蘇的細(xì)胞動(dòng)作要輕柔，避免細(xì)胞破裂。
DMSO對(duì)大多數(shù)細(xì)胞不敏感，所以解凍之后不需要除去DMSO，解凍后頻繁換液會(huì)慢慢除去DMSO。部分對(duì)DMSO敏感的細(xì)胞需要除去DMSO。
解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清，突然換不一樣的培養(yǎng)液和血清會(huì)造成細(xì)胞生長不良，甚至死亡。
下面這些凍存和復(fù)蘇遇到的坑請(qǐng)注意：
1 復(fù)蘇時(shí)遇到凍存時(shí)挖的坑
實(shí)驗(yàn)室偶爾也會(huì)發(fā)生這樣的情況：“靠，細(xì)胞要死了，趕緊凍掉，不能讓細(xì)胞死在我手里?！薄疤炷?，細(xì)胞培養(yǎng)液都這么黃了，趕緊凍掉?！薄皨屟?，細(xì)胞融合度都逼近100%了，趕緊凍掉?！薄斑?，細(xì)胞好像少了點(diǎn)，算了，就這樣吧?！比绻銖?fù)蘇的細(xì)胞就是上面這些人所留下來的，那就要格外注意了。
解決方法：所謂知己知彼才能百戰(zhàn)不殆，在復(fù)蘇前，一定要先清楚地了解這份細(xì)胞的增殖能力。如果增殖能力不高，接種時(shí)就要增加細(xì)胞接種密度并添加5%~10%的血清。如果細(xì)胞本身數(shù)量就非常少，也可以不離心，直接接種培養(yǎng)（加入培養(yǎng)基的體積＞5倍的凍存細(xì)胞體積）。復(fù)蘇后3天內(nèi)盡量少對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操作，延遲換液時(shí)間。
2 無孔不入的微生物
做實(shí)驗(yàn)就像走鋼絲，稍不留神就會(huì)跌進(jìn)充滿微生物的沼澤中不能自拔。
解決辦法：凍存時(shí)，一定要擰緊凍存管的蓋子，否則水浴復(fù)蘇的時(shí)候，水浴鍋中的水就會(huì)滲入到凍存管中去，造成細(xì)胞的污染并會(huì)使那些低免疫力的接受移植的患者產(chǎn)生嚴(yán)重的感染。
3 細(xì)胞非正常“復(fù)蘇”
那是一個(gè)安靜的下午，大家都在專心地做著實(shí)驗(yàn)，突然聽到有人大叫“這是誰的細(xì)胞，一直放在外面，都化了?！痹瓉韯偛磐氯〖?xì)胞的時(shí)候，把整個(gè)凍存架都拿了出來，后來居然忘記再把它放回液氮罐中。而此時(shí)細(xì)胞們已經(jīng)無一幸免地 “融化了”。
解決辦法：馬上種瓶，千萬不要把這些細(xì)胞繼續(xù)放回液氮罐中凍存。此時(shí)細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)有大量的冰晶形成，細(xì)胞膜已經(jīng)受到損傷，如果離心就會(huì)造成細(xì)胞膜完全破碎、細(xì)胞立即死亡的后果。所以切記不要離心，而應(yīng)直接種瓶，也不要進(jìn)行吹打，只輕輕搖晃。培養(yǎng)時(shí)加入10%的血清，種瓶后48h內(nèi)都不要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操作。這是一個(gè)真實(shí)的案例，后來在大家的努力下，那些增殖能力本來就旺盛的細(xì)胞還是活了下來。
備注：本辦法也同樣適用于那些停電后造成超低溫冰箱升溫（一般升溫到-40℃時(shí)就要小心了）的情況。
4 拿錯(cuò)了細(xì)胞，養(yǎng)了別人家的“孩子”
電視劇里抱錯(cuò)孩子的狗血?jiǎng)∏橐餐瑯訒?huì)發(fā)生在實(shí)驗(yàn)室中。學(xué)校的液氮罐基本上都是公用的，所以如果樣本標(biāo)記不詳就會(huì)發(fā)生拿錯(cuò)的情況。
解決辦法：每支凍存管上都應(yīng)用凍存專用的記號(hào)筆詳細(xì)標(biāo)記上細(xì)胞名稱、凍存時(shí)間、樣本批號(hào)等信息并將這些信息詳細(xì)記錄在冊(cè)。存放細(xì)胞時(shí)，最好規(guī)定每個(gè)人的存放位置，免得下次找細(xì)胞的時(shí)候非要把整個(gè)液氮罐翻個(gè)底朝天才找得到。復(fù)蘇拿取細(xì)胞時(shí)，也應(yīng)在對(duì)應(yīng)的存放位置處進(jìn)行查找，找到對(duì)應(yīng)的細(xì)胞后應(yīng)核查記錄冊(cè)上的信息是否與凍存管上的細(xì)胞名稱、凍存時(shí)間、樣本批號(hào)一致。
5 安全第一，細(xì)胞第二
凡是和液氮接觸的操作，都應(yīng)該注意安全。小編的同事Z就在一次打開液氮罐蓋子的時(shí)候被氣體沖擊了眼睛，導(dǎo)致眼睛當(dāng)場(chǎng)流血，不過后來經(jīng)過醫(yī)治已經(jīng)沒有什么大礙了。還有小編的同事L在前單位工作時(shí)有一次在樣本保存室里突然暈倒了（估計(jì)是液氮罐漏氣所致）。
解決辦法：操作人員在接觸液氮罐時(shí)應(yīng)戴防護(hù)面罩、防護(hù)手套，穿防護(hù)衣，防止凍存管或氣體爆裂對(duì)人體造成傷害。在存放液氮罐的房間中也應(yīng)裝有檢測(cè)氣體濃度的報(bào)警裝置，防止人員暈厥的現(xiàn)象發(fā)生。大家在做實(shí)驗(yàn)的時(shí)候一定要小心操作、注意安全。
6 如何讓凍存的組織滿血復(fù)活
很多時(shí)候我們都會(huì)遇到組織復(fù)蘇培養(yǎng)的成功率低、長勢(shì)慢的情況，這到底是哪里出錯(cuò)了呢？
解決辦法：
（1）組織要剪得足夠?。?br />（2）程序降溫盒不要立馬放入-80℃冰箱中，應(yīng)先置于4℃冰箱內(nèi)15min~30min；
（3）凍存液的體積應(yīng)至少是組織體積的2~3倍；
（4）組織復(fù)蘇后進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入5%～10%的血清。
7 復(fù)蘇后，細(xì)胞不見起色就扔掉？！
復(fù)蘇2~3天后，認(rèn)為細(xì)胞沒有明顯增殖就扔掉細(xì)胞，但其實(shí)有些細(xì)胞需要復(fù)蘇一周后才會(huì)發(fā)生明顯的變化。
解決辦法：如果復(fù)蘇培養(yǎng)3天后細(xì)胞仍不見增殖，先不要著急換液。試著補(bǔ)加血清、細(xì)胞因子，等一周后再看細(xì)胞增殖情況再定。
8 心急凍不了好細(xì)胞
凍存時(shí)，不要將細(xì)胞放入剛剛從-80℃冰箱中取出的程序降溫盒內(nèi)（此時(shí)盒內(nèi)的異丙醇還是凍住的）。這樣會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在一開始的時(shí)候就進(jìn)入低溫狀態(tài)，影響細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率。
解決辦法：將程序降溫盒提前拿至室溫中，使細(xì)胞可以從室溫降至-80℃。
常規(guī)的程序降溫盒中是填充了異丙醇的，所以能夠以每分鐘一度的速度進(jìn)行降溫。但是異丙醇屬于有毒溶劑，又容易揮發(fā)，長期使用不但會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染也對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的安全有不利影響。推薦一款新的細(xì)胞程序降溫盒，不需要填充異丙醇就可以正常工作，而且很容易打開蓋子，方便拿取。
轉(zhuǎn)自：abcam、 中洪博元醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)幫、解螺旋
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