中國工程院食品安全院士團隊

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本文介紹了對培養(yǎng)貼壁細(xì)胞系進行傳代的一般工作流程及步驟說明。哺乳類細(xì)胞體外培養(yǎng)是在癌癥、藥物開發(fā)、組織工程、干細(xì)胞、疾病細(xì)胞和分子生物學(xué)等生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域進行臨床和藥物研究的重要模型。要想成功維持細(xì)胞系，需要通過控制生長條件來維持細(xì)胞生理和表型的穩(wěn)定性。定期監(jiān)測細(xì)胞生長，對細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)以確保連續(xù)性。

 背 景 

哺乳類細(xì)胞培養(yǎng)對臨床和藥物研究與應(yīng)用至關(guān)重要，其可用于構(gòu)建靈活的健康和疾病模型系統(tǒng)。例如在機能研究可支持電腦模擬分析并可用于替代動物模型。

細(xì)胞增殖取決于細(xì)胞類型（從動物組織分離的原代細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、自我更新細(xì)胞、穩(wěn)定永生化細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞）和培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、2D/3D細(xì)胞外基質(zhì)、溫度、PH值、CO2/O2濃度）。在最佳培養(yǎng)條件下可以培養(yǎng)出用于各種實驗分析的細(xì)胞。隨著動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進步，細(xì)胞系逐步演變并被用于疫苗生產(chǎn)、治療性蛋白、藥物制劑和抗癌制劑。

要想成功維持哺乳類細(xì)胞系，必須在受控條件下培養(yǎng)細(xì)胞并使用特定培養(yǎng)基。此外，為保證細(xì)胞生理和表型的穩(wěn)定性，必須定期監(jiān)測細(xì)胞生長狀況。通常情況下，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，須對細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)，以確保細(xì)胞生長良好且健康。細(xì)胞匯合度達(dá)80%指的是培養(yǎng)皿80%的表面被細(xì)胞所覆蓋。注意：傳代培養(yǎng)細(xì)胞的最佳匯合度取決于細(xì)胞類型且可能還需優(yōu)化。

本篇文章描述了傳代培養(yǎng)貼壁細(xì)胞系的一般工作流程并附上步驟說明和詳細(xì)圖解（見圖2）。

    為何需要對細(xì)胞進行傳代？  

培養(yǎng)的細(xì)胞不可能無限生長，原因在于在有限的空間內(nèi)細(xì)胞數(shù)量不斷增多，營養(yǎng)物質(zhì)消耗，有毒代謝物增多最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，研究人員通常需要重復(fù)實驗，因此需要對培養(yǎng)細(xì)胞進行削減或擴增。經(jīng)過傳代后細(xì)胞能生成相比原先密度更低的新細(xì)胞。去掉舊的培養(yǎng)基，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基和基質(zhì)中，補充新鮮營養(yǎng)物質(zhì)并清除有毒代謝物能夠長期維持培養(yǎng)細(xì)胞。一開始接種細(xì)胞后，細(xì)胞生長進入遲滯期然后是對數(shù)生長期，此時細(xì)胞呈指數(shù)增殖，接著進入靜止期，此時細(xì)胞生長率和死亡率持平。（見圖1）。進入衰亡期，細(xì)胞因缺乏營養(yǎng)物質(zhì)或培養(yǎng)條件不充足而死亡，例如細(xì)胞因匯合度過高開始爭奪生存空間。

圖1：細(xì)胞生長曲線：培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線包含四個階段：生長開始前的潛伏期（遲滯期）、指數(shù)增長期（對數(shù)生長期）、靜止期（細(xì)胞增殖速度逐漸減慢）、衰亡期（細(xì)胞因缺乏營養(yǎng)物質(zhì)以及生存環(huán)境有問題而死亡）。應(yīng)在對數(shù)生長期更換培養(yǎng)基并在進入靜止期前對細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)。

要使細(xì)胞處于最佳培養(yǎng)條件且維持活躍增長，有必要更新培養(yǎng)基并定期進行傳代培養(yǎng)。可根據(jù)細(xì)胞類型在對數(shù)生長期多次更換培養(yǎng)基。傳代培養(yǎng)的最佳時間位于對數(shù)生長期和靜止期之間，在細(xì)胞達(dá)到密集狀態(tài)前進行。

     為何需要檢查細(xì)胞？  

每日以及在傳代培養(yǎng)前檢查細(xì)胞培養(yǎng)物非常重要，以此監(jiān)測細(xì)胞健康狀況、檢查污染情況、確定細(xì)胞分離時間。首先用肉眼檢查培養(yǎng)基中是否出現(xiàn)真菌污染、培養(yǎng)基渾濁度和顆粒情況，以及通過培養(yǎng)基的顏色變化發(fā)現(xiàn)意外的pH值變化。首先用肉眼檢查培養(yǎng)基中是否出現(xiàn)真菌污染、培養(yǎng)基渾濁度和顆粒情況，以及通過培養(yǎng)基的顏色變化發(fā)現(xiàn)意外的pH值變化。之后應(yīng)使用倒置顯微鏡近距離檢查細(xì)胞整體形態(tài)和生長模式。倒置顯微鏡的光學(xué)元件位于樣本下方。由于細(xì)胞附著在培養(yǎng)皿底部，從底部視角便于觀察。由于正常明場照明下難以觀察到大多數(shù)細(xì)胞，因此應(yīng)在100至200倍的總放大倍數(shù)和相差下進行觀察^[1]。

哺乳類細(xì)胞有很多種形態(tài)，但培養(yǎng)出的哺乳類細(xì)胞大多可分為3類：成纖維細(xì)胞【中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞】、上皮樣細(xì)胞【人類子宮頸（HeLa）細(xì)胞】以及淋巴樣細(xì)胞【人類白血?。℉L60）細(xì)胞】。此外，某些細(xì)胞系具有特定的形態(tài)特征，例如神經(jīng)細(xì)胞（SH-SY5Y）具有很長的樹突。細(xì)胞形態(tài)還受細(xì)胞生命周期活動影響。在有絲分裂過程中，許多細(xì)胞變得更圓，形成可在培養(yǎng)基中漂浮的高折射性發(fā)亮球體。死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性發(fā)生變化，細(xì)胞變得更圓，貼壁細(xì)胞從生長表面分離。在顯微鏡下，死亡細(xì)胞通常不會發(fā)亮及產(chǎn)生折射，它們通常的細(xì)胞膜形態(tài)可能會發(fā)生改變

不同細(xì)胞系不僅尺寸和形狀不同，生長特性也有所不同。它們要么發(fā)展成貼壁細(xì)胞（成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞），要么發(fā)展成懸浮細(xì)胞（淋巴樣細(xì)胞）。大多數(shù)貼壁細(xì)胞系會生成單細(xì)胞層，附著在玻璃或經(jīng)處理的塑料基板上（例如涂有聚賴氨酸、纖連蛋白、膠原蛋白或明膠）。

    如何傳代培養(yǎng)細(xì)胞？  

最常見的傳代細(xì)胞制備方法是使用胰蛋白酶等蛋白水解酶分解細(xì)胞間及細(xì)胞與培養(yǎng)基之間的黏合。胰蛋白酶和乙二胺四乙酸的共同作用使細(xì)胞從生長表面脫離。胰蛋白酶切斷將細(xì)胞固定在培養(yǎng)皿上的黏著斑，乙二胺四乙酸則作為鈣螯合劑。

根據(jù)細(xì)胞類型或下游實驗也可使用其他蛋白酶代替胰蛋白酶，如天然膠原酶或合成消化雞尾酒溶液等。

將參與細(xì)胞間相互作用的鈣粘蛋白中的鈣成分去掉，從而分解鈣粘蛋白，將細(xì)胞分離開來。細(xì)胞一旦失去與生長表面和周圍細(xì)胞的黏合，就能輕易分離并在新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長。細(xì)胞一旦失去與生長表面和周圍細(xì)胞的黏合，就能輕易分離并在新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中生長。圖2描述了傳代培養(yǎng)工作流程的基本步驟。在整個傳代培養(yǎng)過程中重要的是，要在無污染環(huán)境下工作。在傳代培養(yǎng)初始階段、胰蛋白酶分解過程中、細(xì)胞計數(shù)環(huán)節(jié)以及細(xì)胞分離后都要檢查細(xì)胞狀況。保持正確記錄和歸檔對于獲得一致結(jié)果和實驗追溯同樣非常重要。

圖2：傳代培養(yǎng)工作流程中標(biāo)紅的步驟表示需要使用顯微鏡檢查。

以下實驗計劃給出了狗腎臟細(xì)胞在90mm有蓋培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)的基本原則。這些細(xì)胞是從狗的遠(yuǎn)端小管上分離的上皮細(xì)胞。在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞貼壁生長，在實現(xiàn)匯合后形成由多邊形細(xì)胞構(gòu)成的單細(xì)胞層。

需要以下材料和設(shè)備： 

材料：

? 培養(yǎng)基預(yù)熱至 37° C（狗腎臟細(xì)胞需要：MEM培養(yǎng)基加5%FCS胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素）；

? 預(yù)熱不含鈣鎂的PBS緩沖液；

? 在D-PBS緩沖液中預(yù)熱0.05%的胰蛋白酶、0.02%的乙二胺四乙酸；

? 臺盼藍(lán)（活體染劑）；以及消毒用的70%乙醇或異丙醇。

當(dāng)進行無動物源或成分明確的細(xì)胞培養(yǎng)時，使用無血清培養(yǎng)基、FBS/FCS合成替代品及非動物性解離劑。

材料：

? 帶一次性吸頭的細(xì)胞計數(shù)室移液管或微量移液管；

? 支持相差功能的倒置顯微鏡（DMi1，Mateo TL）；

? 防護服和材料；

? 溫度適宜的水浴槽；

? 37°C、含5% CO2、濕度高的培養(yǎng)箱；

? 離心機；

? 離心管；

? 事先標(biāo)注的培養(yǎng)皿。

狗腎臟細(xì)胞的傳代比例應(yīng)為1:10。根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)節(jié)比例。例如原代細(xì)胞培養(yǎng)物、永生化細(xì)胞系、胚胎干細(xì)胞等可能具有不同的最佳比例。

使用徠卡DMi1傳代培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的4步工作流程

 步驟1 
 細(xì)胞檢查 

從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞并放在顯微鏡下快速檢查。應(yīng)每天進行顯微鏡檢查，確保細(xì)胞處于健康狀態(tài)（無污染、死亡細(xì)胞少）并按預(yù)計生長。

在培養(yǎng)貼壁細(xì)胞時，細(xì)胞應(yīng)主要附著在培養(yǎng)皿活燒瓶底部，培養(yǎng)基應(yīng)呈粉橙色。由于培養(yǎng)基中細(xì)胞代謝物（或污染）導(dǎo)致酸化，因此酸堿指示劑酚紅呈黃色。由于培養(yǎng)基中細(xì)胞代謝物（或污染）導(dǎo)致酸化，因此酸堿指示劑酚紅呈黃色。在正常明場照明下難以觀察到這些細(xì)胞。切換至相差可以使細(xì)胞更容易被觀察到。如圖所示，使用DMi1，只需移動聚光鏡環(huán)的滑塊即可選擇相差。

記錄細(xì)胞狀態(tài)對確保各實驗結(jié)果一致十分重要。DMi1可配備攝像頭和屏幕，通過遠(yuǎn)程控制輕松實現(xiàn)成像和保存。研究人員使用Mateo TL集成攝像頭可以拍攝細(xì)胞圖像，追蹤培養(yǎng)基狀況，將圖像轉(zhuǎn)存智能設(shè)備或U盤。

比較狗腎臟細(xì)胞在明場照明和相差圖像中的顯示效果：相差圖像的概覽效果更好，更易于檢查細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞計數(shù)。

 步驟2 
 細(xì)胞提取 

用移液器將培養(yǎng)基吸取至廢物容器中。也可以使用接有真空吸液器的移液器。

使用5ml不含鈣鎂的預(yù)熱PBS緩沖液仔細(xì)沖洗細(xì)胞，沖洗3次，去除殘留培養(yǎng)基中的胎牛血清。胎牛血清及其替代物會抑制胰蛋白酶。加入3ml預(yù)熱胰蛋白酶/乙二胺四乙酸，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使其均勻覆蓋培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞。在37°C下培育幾分鐘即可傳代細(xì)胞。

不同細(xì)胞系需要的胰蛋白酶培養(yǎng)時間不同。為避免過度胰蛋白酶化使細(xì)胞受損，每隔幾分鐘在顯微鏡下檢查一次細(xì)胞。

輕柔地沖洗培養(yǎng)皿，并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至50ml試管中，以800rpm的速度轉(zhuǎn)動5分鐘使細(xì)胞沉降下來。吸走上層清液并在10ml新鮮培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞，徹底去除胰蛋白酶。

分離出的細(xì)胞應(yīng)呈圓形并在胰蛋白酶溶液中自由漂浮。細(xì)胞一經(jīng)分離，即向培養(yǎng)皿中加入5ml培養(yǎng)基，滅活胰蛋白酶。

 步驟3 
 細(xì)胞計數(shù) 

將100μL細(xì)胞懸浮液與等量的0.4%臺盼藍(lán)溶液混合。臺盼藍(lán)選擇性滲入死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜并將其染藍(lán)，但不會被活細(xì)胞吸收。將蓋玻片置于計數(shù)表面上，準(zhǔn)備好血球計。

將移液器吸嘴置于蓋玻片邊緣輕輕擠出細(xì)胞懸浮液，將其滴加在計數(shù)室上（單位面積約4μl）。蓋玻片下的整片區(qū)域發(fā)生毛細(xì)管作用。大多數(shù)情況下，計數(shù)室有兩個計數(shù)區(qū)可各自承接液體。

將計數(shù)室放在顯微鏡載物臺上并將焦點集中在細(xì)胞上。方形計數(shù)網(wǎng)格樣式依計數(shù)室類型而定。圖中所示的Fuchs-Rosenthal血細(xì)胞計數(shù)板有16個區(qū)域，每個區(qū)域1平方毫米，整體被線包圍。每個正方形區(qū)域被細(xì)分為16個小正方形。如圖所示，計算一個區(qū)域內(nèi)16個正方形中的細(xì)胞總數(shù)。為避免重復(fù)計算位于大正方形邊線上的細(xì)胞，僅計算位于正方形兩條邊上的細(xì)胞。在本例中，觸及正方形上方和左側(cè)標(biāo)紅邊線（加粗紅線）的細(xì)胞應(yīng)被計入。觸及下方和右側(cè)紅色邊線的細(xì)胞應(yīng)不被計入。計算計數(shù)室5個1平方毫米區(qū)域內(nèi)的活細(xì)胞和死亡細(xì)胞。要計算最終結(jié)果，需要合計5個正方形的計數(shù)結(jié)果。為求得更精確的測算結(jié)果，也可以計算計數(shù)室其他正方形（大于5個）的細(xì)胞數(shù)量。

使用以下公式可計算細(xì)胞濃度：

此外還可使用細(xì)胞自動計數(shù)器。

 步驟4 
 細(xì)胞植入 

用移液器將所需細(xì)胞量（合適的細(xì)胞數(shù)量）以所需分離率（此處為1:10）吸取至新的培養(yǎng)皿中，在各培養(yǎng)皿中加入所需容積的培養(yǎng)基（10ml）。注意細(xì)胞類型、細(xì)胞分離日期以及培養(yǎng)皿蓋子上的細(xì)胞傳代次數(shù)。將細(xì)胞放回37°C培養(yǎng)箱中。

將細(xì)胞放置一晚，讓其恢復(fù)和沉降。24小時后使用顯微鏡檢查細(xì)胞形狀、黏著性及是否存在污染。

細(xì)胞應(yīng)附著在培養(yǎng)皿底部并已開始生長和分裂。細(xì)胞應(yīng)附著在培養(yǎng)皿底部并已開始生長和分裂。讓細(xì)胞生長直至匯合并準(zhǔn)備好進入實驗或開始下一輪傳代培養(yǎng)。

參考文獻(xiàn)：
1.W. Ockenga, Phase Contrast: Making Unstained Phase Objects Visible, Science Lab (2011) Leica Microsystems.

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